血浆cfDNA提取方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105602938 A (43)申请公布日 2016.05.25

(21)申请号 201610045756.7(22)申请日 2016.01.22

(71)申请人北京圣谷同创科技发展有限公司

地址100089 北京市海淀区东北旺西路8号

9号楼二区104、105号(72)发明人赵明玉 陈威

(74)专利代理机构北京中政联科专利代理事务

所(普通合伙) 11489

代理人柴智敏(51)Int.Cl.

C12N 15/10(2006.01)

权利要求书2页 说明书7页 附图1页

(54)发明名称

血浆cfDNA提取方法(57)摘要

本发明提供了改良的血浆cfDNA的提取方法，包括从全血中分离血浆、裂解、过柱结合、洗涤和洗脱，其中在从全血中分离血浆之前先用福尔马林处理全血，在裂解过程中加大裂解液的用量，并在洗脱之后进一步通过磁珠进行纯化。本发明的方法可以从更少的血浆中提取cfDNA，同时可以得到纯度更高的cfDNA。

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权　利　要　求　书

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1.血浆cfDNA提取方法，包括以下步骤：1)在全血样品中加入10％福尔马林，混匀，随后从全血中分离血浆；2)取不超过1ml的步骤1)分离得到的血浆，向其中加入裂解液进行裂解，所述裂解液的用量大于常规用量；

3)过柱吸附cfDNA；4)洗涤柱；

5)洗脱吸附在柱上的cfDNA；

6)将洗脱后的cfDNA用磁珠进一步纯化，去除大片段和杂质。2.根据权利要求1的方法，其中步骤1)中10％福尔马林的加入量为2.5μL/ml全血。3.根据权利要求2的方法，其中步骤1)为在全血样品中加入EDTA，然后按2.5μL/ml全血的比例加入10％福尔马林，混匀后离心，收集上清。

4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中步骤2)中所使用的裂解液为QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提供的ACL缓冲液，用量为1.6ml ACL缓冲液，且其中含有1.0μg载体RNA。

5.根据权利要求4的方法，其中步骤2)为：取不超过1ml的步骤1)获得的血浆，加入100μl Proteinase K，并加入1.6ml ACL缓冲液(其中含有1.0μg载体RNA)，涡旋混匀，60℃孵育30min，在混合液中按照1.8ml/ml血浆的比例加入buffer ACB，涡旋混匀，冰上孵育5min。

6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中步骤3)中所使用的柱为QIAamp Mini column。7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中步骤6)中所使用的磁珠为Agencourt AMPure XP。

8.根据权利要求7的方法，其中步骤6)为：取步骤5)获得的cfDNA溶液，将其体积设定为1倍体积，加入0.6倍体积的Agencourt AMPure XP，旋涡混匀，室温孵育5min后，放到磁力架上，直到观察溶液澄清，取上清，加入1.2倍体积的Agencourt AMPure XP，旋涡混匀，室温孵育5min后，放到磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，使用200μl新鲜的70％乙醇清洗磁珠两次，分别弃掉上清后，进行短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余的液体，室温干燥磁珠，用水洗脱磁珠，得洗脱液，任选地干燥洗脱液，得到cfDNA。

9.根据权利要求1的方法，包括以下步骤：1)在全血样品中加入EDTA，然后按2.5μL/ml全血的比例加入10％福尔马林，4℃、1600g离心10分钟，将上清再次4℃、16000g离心10分钟，收集上清于-80℃保存；

2)取不超过1ml的步骤1)获得的血浆，加入100μl Proteinase K，并加入1.6ml ACL缓冲液(其中含有1.0μg载体RNA)，涡旋混匀，60℃孵育30min，在混合液中加入1.8ml buffer ACB，涡旋混匀，冰上孵育5min；

3)对步骤2)获得的混合液，取700μl加入到QIAamp Mini column里，8000g离心1min，重复此步骤，直到将步骤2)获得的混合液全部通过QIAamp Mini column；

4)向QIAamp Mini column中依次加入600μl ACW1、750μl ACW2和750μl无水乙醇，每次加入后分别在8000g离心1min，弃上清，最后将QIAamp Mini column再次在20000g离心3min；

5)将步骤4)中得到的QIAamp Mini column在56℃干燥10min，向其中加入40μl超纯水溶解cfDNA，室温孵育3min，离心机20000g离心1min收集cfDNA；

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6)在步骤5)获得的cfDNA中加入25μl的Agencourt AMPure XP，旋涡混匀，室温孵育5min后，放到磁力架上，直到观察溶液澄清，取上清，加入48μL Agencourt AMPure XP，旋涡混匀，室温孵育5min后，放到磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，使用200μl新鲜的70％乙醇清洗磁珠两次，分别弃掉上清后，进行短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余的液体，室温干燥磁珠，用水洗脱磁珠，得洗脱液，任选地干燥洗脱液，得到cfDNA。

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说　明　书血浆cfDNA提取方法

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技术领域

[0001]本发明涉及血浆cfDNA提取方法。

背景技术

[0002]恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，也是全球发病和死亡的主要原因。根据世界卫生组织公布的数据表明，2012年约有1400万新发癌症病例和820万例癌症相关死亡。根据全国肿瘤登记中心发布的2012年数据，中国每年新增病例约350万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数约为250万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。尽管我国在肿瘤的手术、化学药物治疗、放射治疗和生物治疗技术都取得了很大的进展，但人口基数大使我国成为世界上癌症死亡数最高的国家。[0003]肿瘤组织是肿瘤DNA的主要来源。目前临床上主要通过组织活检来获取肿瘤样本进行基因检测，但是这种操作有一定的缺点和局限性。比如，价格贵、对患者有风险，有时无法采集到合适的样本，无法重复多次采样，检测提供的信息可能不够全面准确等，并且这些问题在一些晚期病人上尤为突出。

[0004]细胞游离DNA(cfDNA)所包含的循环肿瘤DNA(ctDNA)是近年来人们通过努力在外周血中找到的新型肿瘤分子标志物，通过它可以实现以非侵入侵的方式对肿瘤进行检测，被称为“液体活检”。循环肿瘤DNA(ctDNA)的发现，及其较高的检出率(例如，针对非小细胞型肺癌，中晚期患者为100％)、特异性(﹥90％)以及和组织检测结果的较高一致性(约为70-80％)，使其成为近年来分子生物学界及医学界的关注热点。随着测序技术的发展，已有不少使用高通量测序技术检测循环肿瘤DNA的研究在高影响因子的学术期刊上发表。已有研究结果表明，循环肿瘤DNA相对于传统的血清生物标记物和循环肿瘤细胞(CTC)具有更好的临床检测灵敏度和预测力，对肿瘤的早期诊断具有一定的参考意义。cfDNA的深度测序也为新的生物标记物和药物靶点的发现提供了可能性。例如，通过对结直肠癌患者血浆cfDNA的全基因组测序,Bardellid发现，在治疗过程中出现的MET的高表达，是患者对西妥昔单抗出现抗性的主要原因。该结果为病人明确了下一靶向药物的方向。此外，血液cfDNA检测，对指导肿瘤患者个体化用药、动态治疗疗效评估、生存预后都具有重要的意义。一旦检测证实出现耐药突变，可以立即停止不必要的持续治疗或改用更合适的治疗药物。这样一方面可以避免患者遭受药物副作用之苦；也可以让医生尽早尝试替代方案，为患者治疗争取时间。最新研究还表明，中晚期肿瘤在发生、发展过程中，发生转移的肿瘤细胞与原发灶相比，其基因突谱可能已经发生变化，因此，治疗过程中的持续监测对于肿瘤的精准治疗也很重要。[0005]血浆约占全血的55％-60％，而血浆中游离DNA(cfDNA)的含量极其微小。目前研究中较常用的血浆cfDNA的提取方法通常包括从全血中分离血浆、裂解、过柱结合、洗涤和洗脱几个步骤，可从少量的人类血浆中高效提取低浓度的游离核酸，但是仍然面临着血浆样本不足、提取的游离DNA量和纯度不够高等问题，即使是目前效果较好的cfDNA抽提试剂盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)，其所需的血浆量最少为1ml，在血浆样本量较低、不足1ml时，不能可靠提取血浆cfDNA。

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发明内容

[0006]本发明的目的是提供改良的血浆cfDNA提取方法，包括从全血中分离血浆、裂解、过柱结合、洗涤和洗脱，其中在从全血中分离血浆之前先用福尔马林处理全血，在裂解过程中加大裂解液的用量，并在洗脱之后进一步通过磁珠进行纯化。本发明的方法可以从更少的血浆中提取cfDNA，同时可以得到纯度更高的cfDNA。[0007]本发明的血浆cfDNA提取方法包括以下步骤：[0008]1)在全血样品中加入10％福尔马林，混匀，随后从全血中分离血浆，得到血浆样品；

[0009]在优选的实施方案中，步骤1)中10％福尔马林的加入量为2.5μL/ml全血。[0010]从全血中分离血浆的方法是本领域技术人员众所周知的，通常通过离心进行分离。

[0011]在进一步优选的实施方案中，在步骤1)中，在全血样品中加入EDTA，然后按2.5μL/ml全血的比例加入10％福尔马林，混匀后离心，收集上清。[0012]在更加优选的实施方案中，在步骤1)中，在全血样品中加入EDTA，然后按2.5μL/ml全血的比例加入10％福尔马林，4℃、1600g离心10分钟，将上清再次4℃、16000g离心10分钟，收集上清于-80℃保存。

[0013]2)取不超过1ml的步骤1)得到的血浆，向其中加入裂解液进行裂解，所述裂解液的用量大于常规用量；

[0014]本发明中所使用的裂解液可以是任何可用于使血浆中cfDNA和与之结合的蛋白质或脂类分开以成为游离cfDNA的裂解液，优选使用市售的用于从血清或血浆中提取cfDNA的裂解液，特别优选可用于从血清或血浆中提取cfDNA的试剂盒中提供的裂解液。“用量大于常规用量”是指裂解液用量大于常规实验规程中的用量或者市售产品的说明书推荐用量。当所述裂解液为市售的用于从血清或血浆中提取cfDNA的裂解液时，特别是可用于从血清或血浆中提取cfDNA的试剂盒中提供的裂解液时，优选其用量为说明书推荐用量的两倍。[0015]在优选的实施方案中，使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)提供的ACL缓冲液(含有载体RNA)作为裂解液，用量为1.6ml且，且其中含有1.0μg载体RNA。裂解液的作用是使血浆中cfDNA和与之结合的蛋白质或脂类分开。[0016]在更优选的实施方案中，在步骤2)中，取不超过1ml的步骤1)获得的血浆，加入100μl Proteinase K，并加入1.6ml ACL缓冲液(其中含有1.0μg载体RNA)，涡旋混匀，60℃孵育30min，在混合液中加入1.8ml buffer ACB，涡旋混匀，冰上孵育5min；[0017]3)过柱吸附cfDNA；

[0018]该步骤中可以使用任何可用于吸附cfDNA的柱。[0019]在优选的实施方案中，使用QIAamp Mini column离心柱过柱吸附cfDNA。[0020]在更优选的实施方案中，将步骤2)获得的混合液分次加入QIAamp Mini column离心柱中，每次加入后进行离心，直至步骤2)获得的混合液全部通过QIAamp Mini column。[0021]在更优选的实施方案中，对步骤2)获得的混合液，取700μl加入到QIAamp Mini column离心柱里，8000g离心1min，重复此步骤，直到将步骤2)获得的混合液全部通过QIAamp Mini column。

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4)洗涤；

[0023]在优选的实施方案中，依次向QIAamp Mini column离心柱中加入ACW1、ACW2和无水乙醇洗涤，每次加入后分别离心弃上清，最后将QIAamp Mini column离心柱再次离心。[0024]在更优选的实施方案中，向QIAamp Mini column中依次加入600μl ACW1、750μl ACW2和750μl无水乙醇，每次加入后分别在8000g离心1min，弃上清，最后将QIAamp Mini column再次在20000g离心3min。

[0025]5)洗脱吸附在柱上的cfDNA；[0026]在优选的实施方案中，将步骤4)中得到的QIAamp Mini column干燥后，加入超纯水溶解cfDNA，室温孵育后离心收集cfDNA。[0027]在更优选的实施方案中，将步骤4)中得到的QIAamp Mini column在56℃干燥10min，向其中加入40μl超纯水溶解cfDNA，室温孵育3min，离心机20000g离心1min收集cfDNA。

[0028]优选地，所述超纯水是18兆欧水。

[0029]6)将洗脱后的cfDNA用磁珠进一步纯化，获得170bp左右的cfDNA片段，去除DNA大片段和其它杂质。

[0030]在一些实施方案中，所述DNA大片段是大于400bp的游离DNA片段。[0031]在优选的实施方案中，使用Agencourt AMPure XP对cfDNA进行进一步纯化。[0032]在更优选的实施方案中，取步骤5)获得的cfDNA溶液，将其体积设定为1倍体积，加入0.6倍体积的Agencourt AMPure XP，旋涡混匀，室温孵育5min后，放到磁力架上，直到观察溶液澄清，取上清，加入1.2倍体积的Agencourt AMPure XP，旋涡混匀，室温孵育5min后，放到磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，使用200μl新鲜的70％乙醇清洗磁珠两次，分别弃掉上清后，进行短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余的液体，室温干燥磁珠，用水洗脱磁珠，得洗脱液，任选地干燥洗脱液，得到cfDNA。[0033]在更优选的实施方案中，在步骤5)获得的40μl cfDNA中加入25μl的Agencourt AMPure XP，旋涡混匀，室温孵育5min后，放到磁力架上，直到观察溶液澄清，取上清，加入48μL Agencourt AMPure XP，旋涡混匀，室温孵育5min后，放到磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，使用200μl新鲜的70％乙醇清洗磁珠两次，分别弃掉上清后，进行短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余的液体，室温干燥磁珠，用水洗脱磁珠，得洗脱液，任选地干燥洗脱液，得到cfDNA。

[0034]上述步骤中，所使用的Proteinase K、ACL缓冲液、载体RNA和buffer ACB、QIAamp Mini column、ACW1、ACW2均由QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)提供，Agencourt AMPure XP来自BECKMAN，其它未提及来源的试剂均通过常规途径购买和/或配制。

[0035]本发明中，所述cfDNA是指细胞游离DNA，即游离于细胞外的DNA，特别是指外周血中的细胞游离DNA。外周血中的细胞游离DNA可能含有宿主基因组DNA、循环肿瘤DNA(ctDNA)(如果存在的话)、和/或胎儿DNA(如果存在的话)。

[0036]本发明通过对现有的血浆cfDNA的提取方法进行改进和优化，实现了更少量的血浆，甚至是200μl的血浆便可得到纯度更高的cfDNA。[0037]本发明的cfDNA提取方法可以降低血浆用量，同时提高提取的cfDNA的纯度和质

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量。虽然不受到理论的束缚，但推测取得这样的效果可能是因为：(1)在cfDNA提取前加入10％福尔马林，可以有效地固定和保护组织细胞和白细胞，防止因细胞破裂，释放基因组DNA而对cfDNA的提取造成的干扰，因此大大提高了cfDNA的提取效率；(2)血浆中的cfDNA与蛋白或脂类结合或包裹在小泡中，增加裂解液用量可以更充分释放cfDNA，同时，裂解液用量的增加可能会导致杂质含量增加，因此在常规提取之后，通过磁珠对产物进行大片段和杂质的纯化，可以提高cfDNA的纯度和质量。附图说明

[0038]图1是使用实施例方法和对照例方法从同一癌症患者的1ml血浆中提取cfDNA的质量控制图对照。

[0039]图2是使用实施例方法和对照例方法从同一癌症患者的200μl血浆中提取cfDNA的质量控制图对照。

具体实施方式

[0040]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

[0041]以下实施例和对照例中所使用的Proteinase K、ACL缓冲液、载体RNA和buffer ACB、QIAamp Mini column、ACW1、ACW2均由QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)提供，Agencourt AMPure XP来自BECKMAN，其它未提及来源的试剂均通过常规途径购买和/或配制。[0042]实施例

[0043]在QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)试剂盒的标准cfDNA提取方法的基础上，进行改进和优化，所做的具体改进主要包括：(1)在分离血浆之前按2.5μL/ml血浆的比例加入10％福尔马林；(2)将血浆与裂解液的比例由1:0.8改为1:1.6；(3)在原有提取步骤结束后，增加了通过磁珠对产物进行纯化的步骤。具体步骤如下：[0044]1、样本采集和血浆的分离

[0045]取10ml检测者血液抽取到含有EDTA的10ml的抽血管中并加入25μL10％的福尔马林，颠倒混匀，4℃、1600g离心10分钟，将上清再次离心(4℃，16000g，10分钟)以除去残留细胞，收集上清(即血浆)于-80℃保存。[0046]2、裂解

[0047]取1ml步骤1获得的血浆加入到离心管中，并在每个离心管中加入100μl Proteinase K、1.6mL ACL缓冲液(含有1.0μg载体RNA)，涡旋混匀。60℃孵育30min。将混合液移至已加入1.8ml buffer ACB的5ml离心管或10ml离心管中，涡旋混匀，冰上孵育5min。[0048]除使用1ml血浆提取cfDNA之外，还使用200μl血浆提取cfDNA，以验证使用本发明方法从更少量血浆中提取cfDNA的效果。当用200μl血浆提取cfDNA时，裂解步骤为：取200μl步骤1获得的血浆样品加入到离心管中，并在每个离心管中加入100μl Proteinase K、1.6mL ACL缓冲液(含有1.0μg载体RNA)，涡旋混匀。60℃孵育30min。将混合液移至已加入

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1.8ml buffer ACB的5ml离心管或10ml离心管中，涡旋混匀，冰上孵育5min。后续的过柱吸附、洗涤、洗脱、cfDNA和纯化步骤以及这些步骤中试剂的用量与用1ml血浆提取cfDNA相同，如下所述。[0049]3、过柱吸附[0050]取700μl混合液加入到QIAamp Mini column离心柱里，8000g离心1min，重复此步骤，直到将混合液全部通过Mini column。[0051]4、洗涤

[0052]向Mini column中依次加入600μl ACW1、750μl ACW2和750μl无水乙醇，每次加入后分别离心(8000g，1min)弃上清。最后将Mini column放入新的2ml收集管中，20000g离心3min。

[0053]5、洗脱

[0054]将Mini column放入一新的离心管中，56℃干燥10min(开盖)。向Mini column中加

室温孵育3min。离心机20000g离心1min收集cfDNA。入40μl 18兆欧水洗脱cfDNA，

[0055]6、cfDNA纯化和洗脱

[0056]向含有上述cfDNA的1.5ml离心管中加入25μl的Agencourt AMPure XP，旋涡混匀，室温孵育5min后，将离心管放到磁力架上，直到观察溶液澄清。转移上清到含有48μL Agencourt AMPure XP的离心管中，旋涡混匀。室温孵育5min后，把离心管放到磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。使用新鲜的70％乙醇(200μl)清洗珠子两次，分别弃掉上清。对离心管进行短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余的液体，室温干燥5分钟。用20μL水洗脱磁珠，得到将纯化的cfDNA溶液，使用

2.0荧光计对该cfDNA溶液进行浓度测定。用1ml血浆提取

的cfDNA测得浓度为0.580ng/μl，用200μL血浆提取的cfDNA测得浓度为0.136ng/μl。[0057]7、质控

[0058]取步骤6中的用纯化cfDNA溶液，加入到Agilent 2100Bioanalyzer进行质控分析，按说明进行操作。用1ml血浆提取的cfDNA和用200μL血浆提取的cfDNA的质控结果分别如图1b和图2b所示。[0059]对照例

[0060]基本为QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)试剂盒的标准cfDNA提取方法，具体步骤如下：[0061]1、样本采集和血浆的分离

[0062]与实施例1方法同时取同一检测者血液10ml，置于含有EDTA的10ml的抽血管中，4℃、1600g离心10分钟，将上清再次离心(4℃，16000g，10分钟)以除去残留细胞，收集上清(即血浆)于-80℃保存。[0063]2、裂解

[0064]取1ml步骤1获得的血浆加入到离心管中，并在每个离心管中加入100μl Proteinase K、0.8mL ACL缓冲液(含有1.0μg载体RNA)，涡旋混匀。60℃孵育30min。将混合液移至已加入1.8ml buffer ACB的5ml离心管或10ml离心管中，涡旋混匀，冰上孵育5min。[0065]除使用1ml血浆提取cfDNA之外，还使用200μl血浆提取cfDNA，以与本发明方法进行比较，证明本发明方法从更少量血浆中提取cfDNA的效果。当用200μl血浆提取cfDNA时，裂解步骤为：取200μl步骤1获得的血浆样品加入到离心管中，并在每个离心管中加入100μl 

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Proteinase K、0.8mL ACL缓冲液(含有1.0μg载体RNA)，涡旋混匀。60℃孵育30min。将混合液移至已加入1.8ml buffer ACB的5ml离心管或10ml离心管中，涡旋混匀，冰上孵育5min。后续的过柱吸附、洗涤、洗脱步骤以及这些步骤中试剂的用量与用1ml血浆提取cfDNA相同，如下所述。[0066]3、过柱吸附[0067]取700μl混合液加入到QIAamp Mini column离心柱里，8000g离心1min，重复此步骤，直到将混合液全部通过Mini column。[0068]4、洗涤

[0069]向Mini column中加入依次加入600μl ACW1、750μl ACW2和750μl无水乙醇，每次加入后分别离心(8000g，1min)弃上清。最后将Mini column放入新的2ml收集管中，20000g离心3min。[0070]5、洗脱

[0071]将Mini column放入一新的离心管中，56℃干燥10min(开盖)。向Mini column中加入40μl 18兆欧水洗脱cfDNA，室温孵育3min。离心机20000g离心1min收集cfDNA，将cfDNA室温干燥5分钟后，加入20μL水溶解干燥的cfDNA得到纯化cfDNA溶液，使用

2.0荧光计

进行浓度测定。用1ml血浆提取的纯化cfDNA溶液测得浓度为0.346ng/μl，用200μL血浆提取

说明未能成功提取cfDNA。的纯化cfDNA溶液未测得浓度，

[0072]6、质控

[0073]取步骤5中获得的纯化cfDNA溶液，加入到Agilent 2100Bioanalyzer进行质控分析，按说明进行操作。用1ml血浆提取的cfDNA和用200μL血浆提取的cfDNA的质控结果分别如图1a和图2a所示。[0074]结果比较[0075]1、使用实施例方法和对照例方法从同一癌症患者的1ml血浆中提取的纯化cfDNA溶液浓度分别为0.580ng/μl大于0.346ng/μl，可见使用实施例方法提取的cfDNA更多。[0076]图1是使用实施例方法和对照例方法从同一癌症患者的1ml血浆中提取cfDNA的质量控制图对照，其中a为使用对照例方法提取cfDNA的质量控制图，b为使用实施例方法提取cfDNA的质量控制图。图1a和1b中横坐标为移动时间，可反映DNA片段的大小(碱基数，bp)，纵坐标为荧光强度，可反映DNA片段的浓度。图中每一个峰代表一定碱基长度(峰上方数字代表了该DNA片段的碱基数)的DNA片段。图中所示的35bp和10380bp的DNA片段为标记物，长度为171bp左右的为需要的cfDNA片段，其余峰为大片段DNA和杂质。由图1a和1b的比较可知，用实施例方法提取的cfDNA浓度更高，且含有更少的大片段DNA杂质。[0077]2、使用实施例方法从癌症患者的200μl血浆中提取的纯化cfDNA溶液浓度为0.136ng/μl，而使用对照例从同一癌症患者的200μl血浆中提取cfDNA时未测得cfDNA浓度，说明未能成功提取。

[0078]图2是使用实施例方法和对照例方法从同一癌症患者的200μl血浆中提取cfDNA的质量控制图对照，其中a为使用对照例方法提取cfDNA的质量控制图，b为使用实施例方法提取cfDNA的质量控制图。图2a和2b中横坐标为移动时间，可反映DNA片段的大小(碱基数，bp)，纵坐标为荧光强度，可反映DNA片段的浓度。图中每一个峰代表一定碱基长度(峰上方数字代表了该DNA片段的碱基数)的DNA片段。图中所示的35bp和10380bp的DNA片段为标记

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物。由图2a和2b的比较可知，用实施例方法可以成功从200μl血浆中提取cfDNA，而对照例方法则无法从200μl血浆中提取获得cfDNA。[0079]应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

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CN 105602938 A

说　明　书　附　图

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图1

图2

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